為了兼顧既保存較好的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)又保證較好的雜交反應(yīng)兩者之間的關(guān)系，在電鏡原位雜交中應(yīng)注意以下幾點：
1．選擇合適的固定劑 所用固定劑為交聯(lián)固定劑，如甲醛和戊二醛，既能良好保存細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，又能有效地保存組織細(xì)胞中的核酸，尤其是RNA分子。這類交聯(lián)固定劑，尤其是戊二醛，主要缺點是影響探針對靶核酸的可及性，當(dāng)細(xì)胞中靶核酸序列的拷貝數(shù)很少時，這種影響尤為明顯。所以。一般主張用較低濃度(0．1％一0．5％)的戊二醛或與4％多聚甲醛聯(lián)合使用。在實驗中可試用不同濃度的多聚甲醛和(或)戊二醛，以摸索*濃度。
鋨酸是電鏡技術(shù)中常用的一種固定劑，但經(jīng)鋨酸固定的組織，RNA的保留較差。在原位雜交技術(shù)中，標(biāo)本在原位雜交反應(yīng)后再用鋨酸進(jìn)行后固定似乎不影響標(biāo)記信號，這樣有利于膜結(jié)構(gòu)的保存，可增加細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)的電子密度反差。
選擇合適的探針 放射性和非放射性探針都可用于電鏡原位雜交。與光鏡原位雜交反應(yīng)一樣，用放射性核素標(biāo)記的探針做電鏡原位雜交，其敏感性較高，標(biāo)記物不干擾雜交反應(yīng)，并且結(jié)果適于進(jìn)行定量分析。常用的放射性核素為3H、35S、125I和32P。3H的β射線能量zui低。雜交信號能得到*的亞細(xì)胞定位，但放射自顯影的曝光時間較長。35S的β射線能量較高，故其亞細(xì)胞定位不如’H，但放射自顯影時間較短，實際應(yīng)用中應(yīng)用zui廣。應(yīng)用非放射性標(biāo)記探針進(jìn)行電鏡原位雜交不需長時間進(jìn)行放射自顯影，又可避免放射性核素的污染問題，而且其分辨率即雜交信號的亞細(xì)胞定位要比放射性核素標(biāo)記探針好。在電鏡原位雜交中用得zui多的非放射性標(biāo)記物是生物素。雜交體上的生物素可用HRP或膠體金標(biāo)記的抗生物素抗體、A蛋白或卵白素來檢測。
如果用強(qiáng)交聯(lián)劑固定，應(yīng)選擇較短序列的探針，使探針易于滲透，提高雜交反應(yīng)效率。
3．適宜的雜交前處理 雜交前處理中應(yīng)盡量避免蛋白 酶消化，去污劑Triton X-100的濃度也應(yīng)降低，以不高于o．02％為宜。因醋酸酐處理能破壞細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)，故應(yīng)避免。
4．適宜的檢測方法 電鏡原位雜交的雜交信號必須具有高電子密度，只有這樣才能在電鏡下識別。
放射性核素標(biāo)記探針電鏡原位雜交的雜交體用放射自顯影術(shù)檢測。電鏡放射自顯影要求分辨率*，與光鏡放射自顯影相比，于電鏡放射自顯影的核乳膠的銀粒較細(xì)，一般要求銀粒直徑在1．6X10―；m以下。制備電鏡自顯影標(biāo)本時，要求乳膠層薄到只有一層溴化銀晶體的厚度，稱為單層乳膠。在單層乳膠中，溴化銀晶體彼此接近，既不互相重疊，又不留有無溴化銀晶體的空隙。當(dāng)超微結(jié)構(gòu)中體積極小的放射源的核射線穿透單層乳膠時，只使距放射源zui近的銀粒曝光。而射線不作用于其他的銀晶體上，不至造成影像彌漫泛化。
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